Алгоритмы разрешения проблем предтрансфузионного иммуногематологического тестирования

Введение

При проведении трансфузий эритроцитсодержащих компонентов могут возникать проблемы, обусловленные присутствием в крови реципиентов и доноров аллоиммунных антиэритроцитарных антител (антител, синтезируемых при попадании в кровь данного лица внешнего чужеродного эритроцитарного антигена, т.е. антигена, которого нет на эритроцитах этого человека) и/или аутоиммунных антиэритроцитарных антител (антител, синтезируемых при ряде заболеваний против собственных антигенов эритроцитов данного человека) . Аллоантитела нередко являются клинически значимыми, так как могут вызывать гемолиз донорских эритроцитов. При этом аллоантитела разных специфичностей имеют разные свойства, что требует дифференцированного подхода к их детекции. Аутоантитела, вызывая панагглютинацию, могут затруднять определение группы крови и резус-фенотипа, маскировать присутствие аллоантител. Предтрансфузионные скрининг и идентификация антиэритроцитарных аллоантител, их дифференциров- ка от аутоантител и на этой основе подбор совместимой донорской крови необходимы для профилактики посттрансфузионных реакций и осложнений . Автором совместно с сотрудниками были проведены исследования антител у более чем 200 тысяч больных и более чем 100 тысяч доноров. Результаты исследований опубликованы ранее .

Цель работы — составить алгоритмы предтрансфузионного иммуногематологического тестирования. Разработанные алгоритмы будут способствовать повышению качества иммуносерологического обследования и снижению риска развития иммунных посттрансфузионных реакций и осложнений после гемотрансфузий.

Аллоиммунные антитела при беременности

Этот анализ является надежным методом выявления возможности резус-конфликта на ранних стадиях беременности. Rh-положительным женщинам он не требуется, назначается только беременным с Rh-отрицательным статусом.

Этих будущих рожениц ставят на особый учет, проводят регулярный динамический контроль за уровнем аллоиммунных антител:

Первое обследование выполняется с 7 по 20 неделю вынашивания.
До 30 недели анализ сдается ежемесячно.
С 30 по 36 недели – каждые две недели.

Если Rh-отрицательная женщина вынашивает резус-положительный плод, но аллоиммунные антитела не выявлены, показано профилактическое введение специфических гамма-глобулинов. Они позволяют предотвратить выработку антител и способствуют безопасному протеканию первой и последующих беременностей.

Если антитела уже присутствуют в организме женщины – введение гамма-глобулинов не назначается, так как они могут только препятствовать образованию новых антител, но не снижают титр уже существующих.

Важно знать!

Данные антитела могут присутствовать в небольших количествах, которые невозможно выявить стандартными методами диагностики. Поэтому результаты единичных анализов не всегда можно считать достоверными.
При негативных результатах теста на антитела у резус-негативных беременных с Rh+ ребенком есть небольшая вероятность развития гемолиза у новорожденных.
Если женщина проходила курс лечения специфическими гамма-глобулинами, препятствующими образованию аллоиммунных антител анализ может давать положительный результат в течение 6 мес.
Если отцом ребенка Rh- женщины будет резус-негативный мужчина – риска возникновения резус-конфликта нет, то меры специфической профилактики не требуются.

Динамический контроль и диагностика

Чтобы спрогнозировать, как будет развиваться беременность, важно чтобы женщина как можно раньше пришла на консультацию (в особенности это касается тех случаев, если это вторая или третья беременность), а у нее ранее диагностировали сенсибилизацию антителами или гемолитическую болезнь новорожденного/плода. Чтобы контролировать процесс протекания беременности важно:

Чтобы контролировать процесс протекания беременности важно:

во время постановки на учет все беременные в обязательном порядке проходят такое лабораторное исследование, как определение группы крови и резус – фактора;
если у женщины был выявлен отрицательный резус, пройти исследование рекомендуют и отцу;
если опасения подтвердились и у родителей разный резус – фактор, то беременной до 20 недели каждые 8 дней проводят анализы на наличие титр антител;
определяют вид иммуноглобулинов (IgG или IgM);
после 20 недели беременную направляют на наблюдение в специализированный центр;
с 32 недели анализы на титр антител делают один раз на 14 дней, а с 35 недели — раз в 7 дней;
спрогнозировать ситуацию можно по сроку гестации, в котором обнаружили антитела. Он будет тем неблагоприятное, чем ранее были обнаружены иммуноглобулины к резус – фактору.

Если антитела обнаружили при второй беременности, возникновение резус – конфликта увеличивается, поэтому без инвазивных или не инвазивных методов лечения не обойтись.

Что следует учитывать при проведении анализа?

Чтобы результат анализа был максимально достоверным, при проведении процедуры необходимо соблюдать ряд условий:

реагенты должны храниться в холодном месте при температуре +2-8 градусов во флаконах с плотно закрученной крышкой (в случае нарушения правил хранения они быстро теряют свои свойства);
для проведения анализа нельзя использовать цоликлоны с истекшим сроком хранения (он составляет около 30 дней) или жидкости, которые содержат осадок, хлопья или мусор;
исследование выполняется в хорошо освещенном помещении при температуре воздуха не ниже +15 и не выше +25 градусов, причем в нем не должно быть грязи, пыли и других факторов, способных исказить результат;
при нанесении биоматериала и реагентов на поверхность планшетки следует точно соблюдать пропорции – если крови будет слишком много, реакцию сложнее отследить, а в противоположном случае (при малом объеме) она будет слишком медленной;
нельзя допускать, чтобы капли крови, смешанные с разными типами цоликлонов, сливались вместе – если это случилось, исследование проводят заново; по этой же причине для смешивания реагентов с биоматериалом следует использовать разные палочки.

Продолжительность реакции должна составлять не менее 3 минут, а при сомнительном результате время наблюдения за образцами биоматериала следует продлить до 5 минут. Однако по истечении 10 минут может произойти подсыхание биоматериала и естественное выпадение эритроцитов в осадок, поэтому доверять такому исследованию не стоит.

Типы групп крови

Первым заявил о том, что кровь отдельных людей отличается, австрийский ученый Карл Ландштейнер, обнаруживший в начале ХХ века, что на поверхности эритроцитов существуют особые группы белков, отвечающих за реакции иммунной системы. Эти антигены, отличаются по структуре и при попадании в плазму другого человека, распознаются как чужеродные белки, вызывающие выработку антител. Антитела приводят к склеиванию (агглютинации) чужеродных эритроцитов, с целью удаления из организма.

Ученый определил две антигенные системы в эритроцитах: А и В. На этом основании он выделил три группы крови А, В и 0.

Автор обозначения групп крови как 0, A, B и AB (принято во всем мире в 1928 г.) — польский ученый Людвик Гиршфельд. Он также определил резус-фактор и открыл законы наследования групп крови. В 1950 году за описание сущности серологического конфликта был номинирован на Нобелевскую премию по медицине.

В дополнение к известным системам AB0 и Rh, описано более 30 других систем групп крови. Одни затрагивают всех людей, другие встречаются только в определенных семьях или популяциях. Наиболее известны: AB0, Rh, Kell, Duffy, Lewis, Kidd. Хотя в случае Европы наибольшие различия в антигенах наблюдаются преимущественно в системах AB0 и Rh, во время подготовки к переливанию крови всегда необходимо выполнять перекрестный тест, чтобы исключить наличие в крови донора других антител, направленных против более редких групповых систем.

Методы определения резус-фактора и группы крови

Методы анализа можно условно разделить на две категории:

Первичный анализ на определение группы крови и резуса моноклональными антителами анти-А, анти-В и анти-D
Повторная диагностика перекрестным методом и изогемагглютинирующими сыворотками

Современный и наиболее простой способ. Для исследования берется венозная кровь, цоликлоны Анти-А, Анти-В и Анти-D, а также раствор натрия хлорида 0,9%. Также нужен специальный планшет и стерильные палочки. Группа и Rh определяются в зависимости от обнаружения реакции склеивания и осаждения (агглютинации) эритроцитов.

Определение резус-принадлежности и группы цоликлонами анти-А, анти-В и анти-D

Кровь соединяют с реагентом, который содержит антитела: к каждой капле крови отдельно добавляют цоликлон анти-А, анти-В или анти-D (последний — тест на резус-фактор).

Расшифровка полученных данных:

Агглютинация не произошла ни с антигеном А, ни с антигеном В — у пациента первая группа (0)
Склеивание эритроцитов наступило с антигеном А — взятая кровь имеет вторую группу (А)
Агглютинация произошла с антигеном В — третья (В)
Реакция наступила с антигенами А и В — кровь четвертой группы (АВ)
Склеивание эритроцитов наблюдалось с цоликлоном анти-D — положительный резус-фактор (Rh+)
Склеивание эритроцитов с цоликлоном анти-D не наступила — отрицательный резус-фактор (Rh-)

Такой метод позволяет дать обозначение группы крови и резуса по системам АВ0 и Резус.

Повторное исследование по стандартным сывороткам

Методика подразумевает применение стандартных изогемагглютинирующих сывороток всех четырех групп крови. Для первой группы применяется бесцветная сыворотка, для второй — синяя, третьей — красная, четвертой — желтая.

Принцип методики заключается в поиске антигенов А и В путем агглютинации.

Перекрестный способ определения группы крови

Выявление антигенов А и В при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток и антител α, β при помощи стандартных эритроцитов. Анализируют реакцию по вышеописанным методикам.

Информация об исследовании

Резус-фактор и другие иммуногенные белки эритроцитарной мембраны передаются по наследству. Большинство населения (около 85%) относится к группе резус-позитивных, то есть в мембране их клеток крови присутствуют эти специфические белки. У некоторого количества людей они не синтезируются, их относят к группе резус-негативных.

Отсутствие либо наличие резус-фактора никак не отражается на общем состоянии человека. Но могут возникать ситуации, когда резус-негативная женщина беременеет Rh-позитивным ребенком. В этом случае есть риск, что организм матери начнет производить антитела против крови ребенка. Результатом может стать гемолитическая болезнь новорожденного, выкидыш, ряд других осложнений течения беременности.

При первом вынашивании риски для ребенка невелики, но антитела сохраняются длительное время. Риск резус-конфликта при каждой следующей беременности быстро растет. Антитела длительное время циркулируют в крови, свободно проникают через плацентарный барьер. Определение антител к резус-антигенам эритроцитов – надежный, достоверный метод обнаружения вероятности резус-конфликта на ранних стадиях беременности.

Наличие высоких титров антител, может быть причиной гемолитической болезни. При этом заболевании антитела из материнской крови проникают в плод, разрушают эритроциты в крови ребенка. В результате развивается гемолитическая желтуха, поражаются почки, печень, другие органы новорожденного.

Анализ позволяет определить присутствие антител на ранних сроках беременности, следить за динамикой развития процесса, своевременно назначить соответствующее лечение.

Также этот анализ применяется перед переливанием крови для выяснения потенциальной возможности несовместимости крови донора с реципиентом по резус-системе. Особенно если пациент ранее получал переливание донорской крови.

Проводится анализ методом агглютинации, то есть склеивания. Она подразумевает, что присутствие специфических антител в крови проявится при смешивании ее с соответствующими антигенами. Произойдет склеивание эритроцитов и выпадение их в осадок. Если агглютинация произошла – анализ считается положительным, если нет – отрицательным.

Список литературы

1. Garratty G., Arndt P.A. Positive direct antiglobulin tests and hemolytic anemia following therapy with beta-lactamase inhibitor containing drugs may be associated with nonimmunologic adsorption of protein onto red blood cells. Br J Haematology.1998; 100: 777–83.

2. Issitt P.D., Anstree D.J. Applied blood group serology. 4th ed. Montgomery: Scientific Publications; 1998. 1208 p.

3. Milkins C., Berryman J., Cantwell C., et. al. Guidelines for pre-transfusion compatibility procedures in blood transfusion laboratories. British Committee for Standards in Haematology. Transfusion Medicine. 2013; 23(1): 3–35.

4. Минеева Н.В., Бодрова Н.Н., Заварзина О.А. и др. Анализ ошибок при проведении иммуногематологических исследований. Вестник службы крови. 2007; 2: 3–5.

5. Минеева Н.В. Совершенствование системы обеспечения трансфузий, совместимых по антигенам эритроцитов. Здравоохранение и медицинская техника. 2004; 5(9): 25–7.

6. Минеева Н.В., Бутина Е.В. Иммуногематологическое обследование доноров крови и (или) ее компонентов и реципиентов. Методические указания МУ ФМБА России 11.6.1-2017.

7. Пашкова И.А., Рыжанова Л.Г., Федоренко Т.В. и др. Анализ специфичности аллоиммунных антител, выявленных у реципиентов. Гематология и трансфузиология. 2009; 54(5): 31–4.

8. Pashkova I., Porhanov V., Gilevich I., et al. Surgeon patients and Transfusion in a Krasnodar regional hospital. Vox Sanguinis. 2013; 105(1): 266.

9. Brecher M.E. (editor). Technical Manual AABB, 15th Edition. 2005. 407–81 p.

10. Haas F.J.L.M., van Rhenen D.J., de Vries R.R.P. Guidelines for compatibility procedures in blood transfusion laboratories. Transfusion Medicine. 2004; 14: 59–73.

11. Минеева Н.В. Группы крови человека. Основы иммунологии. СПб.; 2004. 188 с.

12. Прокоп О., Гелер В. Группы крови человека. М.: Медицина; 1991. 511 с.

13. Минеева Н.В. Антитела к антигенам эритроцитов и методы их выявления. Методические рекомендации. СПб.; 2000. 14 с.

14. Минеева Н.В., Бодрова H.H., Трофимова С.А. Значение ферментного метода для выявления клинически значимых антиэритроцитарных антител. Новое в трансфузиологии. 2001; 29: 55–8.

15. Klapper E., Zhang Y., Figueroa P., et. al. Toward extended phenotype matching: a new operational paradigm for the transfusion service. Transfusion. 2010; 50(3): 536–46.

16. Sapatnekar S., Figueroa P.I. How do we use molecular red blood cell antigen typing to supplement pretransfusion testing? Transfusion. 2014; 54(6): 1452–8.

17. Garratty G., Postoway N., Nance S., Brunt D. Spontaneous agglutination of red cells with a positive direct antiglobulin test in various media. Transfusion. 1984; 24: 214–7

Роль иммуноглобулинов

Антитела делятся на несколько классов: иммуноглобулины А, E, D, G, M. Иммуноглобулины типа А участвуют в первичном поверхностном контакте с микробами, в частности препятствуют проникновению микробов в организм, формируют антитоксический иммунитет. Они способны создавать особые полимерные формы – секреторный иммуноглобулин А. Именно этот иммуноглобулин препятствует прикреплению чужеродного агента к клеткам пограничных тканей (слизистых оболочек). Благодаря иммуноглобулинам типа G и M осуществляется защита организма от уже проникших внутрь инфекционных агентов. Ранними защитными белками являются иммуноглобулины М, а иммуноглобулины класса G являясь основным фактором гуморального звена иммунитета человека, отвечают за выздоровление организма в целом. К тому же, иммуноглобулины этого класса могут на протяжении долгого времени защищать от повторного внедрения различных микроорганизмов. Иммуноглобулины Е несут ответственность за возникновение аллергической реакции.

Основные показания для обследования иммунитета

Мы обследуем иммунную систему, если заболевание протекает при ее участии. В основном, это:

Наличие хронического воспаления где-либо, когда иммунитет не в силах справиться с инфекцией (тонзиллит, фарингит, бронхит, цистит, пиелонефрит, гастрит, дисбактериоз, простатит, уреаплазма, молочница, герпес и др.);
Наличие аутоиммунного, ревматического заболевания, когда иммунитет может проявлять агрессию к здоровым тканям организма, принимая их за чужеродные;
Частые (более 6 раз в год) и длительные заболевания «простудами»: инфекционные заболевания кожи, слизистых, дыхательных путей с длительным течением и низкой эффективностью при лечении антибиотиками
Аллергия;
Нейроинфекции, в т.ч., арахноидит;
Риск онкологических заболеваний (снижение противоопухолевого иммунитета, неблагоприятная наследственность, радиоактивное облучение и др.), состояние после операций, химиотерапии, лучевой терапии.
Повышение температуры на протяжении 2-х недель без причины
Увеличение лимфатических узлов
Снижение массы тела без видимой причины
Чувство усталости, боли в мышцах, потеря работоспособности
Частые рецидивы герпеса, молочницы, тонзиллита, фарингита, ринита, гайморита, дерматита цистита, пиелонефрита, бронхита и других хронических воспалительных заболеваний

Общая сопротивляемость организма

В результате вокруг микроорганизма формируется очаг воспаления, который с одной стороны является барьером, направленным на предотвращение распространения возбудителя, а с другой – предупреждает организм о вторжении чужеродного агента. Далее происходит распознавание опасного агента и выработка факторов защиты против конкретного микроба, а также его частичное разрушение. Кроме того, формируется иммунологическая память о данных процессах, благодаря которой при следующей атаке этого микроба (антигена) запуститься сигнал для распознавания его особыми клетками иммунной системы. После того, как микроб изолирован и распознан, он подвергается полному уничтожению.

Показания к проведению иммуногематологического анализа

Поводом для исследования являются:

беременность или ее планирование (антигенный набор крови будущего ребенка может конфликтовать с материнским, что приводит к осложнению беременности, заболеваниям плода и выкидышам);
гемолитические патологии медикаментозного, аутоиммунного или посттрансфузионного генеза;
определение совместимости между реципиентом и донором перед переливанием крови;
подготовка к хирургическому вмешательству.

СПРАВКА! На поверхности эритроцитов находится несколько сотен антигенов, которые составляют 15 различных групповых систем крови. Наиболее известные из них – система АВ0 и резус. Помимо этого существуют менее распространенные системы Келла, Левиса, Даффа, Аубергера и др. Кроме того, тромбоциты и лейкоциты имеют собственный набор антигенов (HLA).

Функции интерферонов

В ответ на действие различных антигенов (к примеру, вирусов) клетки иммунной системы образуют сложные белковые соединения – интерфероны, которые осуществляют ряд защитный функций. Выделяют несколько типов интерферонов. Стоит отметить интерфероны 1 типа – альфа, которые обладают противовирусным эффектом. Человек, после инфицирования вирусным агентом некоторое время еще не знает о болезни (продромальный период инфекции). Но интерфероны альфа уже проявляют заботу. Они способны создавать невосприимчивость клеток к инфицированию вирусами, а в уже поврежденных клетках – блокируют размножение вирусов.

Как проводится исследование?

Для определения группы крови с использованием цоликлонов необходима плоская ровная поверхность (планшетка), смоченная водой, набор химических реагентов и пробы биологической жидкости, причем специалист может использовать любую кровь: капиллярную, венозную, замороженную и т. д.

Стороны планшета помечают, чтобы не перепутать, на какую из них будет нанесен тот или иной тип цоликлонов.
На поверхность капают по одной капле реагентов (обычно цилоклоны анти-А и анти-В) и крови, причем объем химических веществ должен в 8-10 раз превышать объем биоматериала.
Подождать 3-5 минут, аккуратно покачивая планшет, чтобы жидкости хорошо смешались, а эритроциты не оседали по краям образцов.

Аутоконтроль

Аутоконтроль — тест на взаимодействие сыворотки и эритроцитов исследуемой крови. При скрининге и идентификации аллоантител аутоконтроль необходимо проводить во всех случаях. В норме сыворотка крови не может вызывать агглютинацию собственных эритроцитов. Отрицательный аутоконтроль при определении аллоантител подтверждает специфичность реакций исследуемой сыворотки с тестовыми эритроцитами. Положительный аутоконтроль доказывает присутствие в тестируемой крови аутоантител. В этом случае следует проверить, есть ли в крови кроме аутоантител также и аллоантитела, т.е. провести дифференцировку (иногда аутоконтроль позволяет сделать предварительные предположения по этому вопросу путем сравнения реакции агглютинации с аутологичными и стандартными эритроцитами).